體外診斷試劑的原料可以分為兩大類

  一類是具有生物活性的可以特異性識別待測靶分子或催化其反應的生物大分子原料。

  另外一類是不直接參與反應的各類有機和無機的小分子物質的非生物活性原料。

  體外診斷試劑原料是指用于生化、免疫或分子診斷等試劑的反應體系原料，主要指反應體系。按照性質不同，體外診斷試劑原料可以分為：抗原和抗體、酶與輔酶以及其他原料。上游原料決定了體外診斷試劑檢測水平質量的好壞，可以說這些關鍵原材料的選擇和研制，影響體外診斷試劑各項性能水平(如靈敏度、穩定性)和應用價值，篩選到合適的原材料是研發的首要環節。也是體外診斷試劑成本構成主要的部分。

  那么生物活性原材料主要包括哪些呢?

  一是抗原：包括蛋白質，多糖，多肽，脂，小分子化合物等，有天然抗原和人工抗原，從生物組織或細胞直接獲得的為天然抗原，通過基因工程，化學合成等方法制備的抗原為人工抗原。

  二是抗體，主要包括單克隆抗體和多克隆抗體。

  三是酶，在體外診斷試劑原料中統稱為工具酶。

  其他原料

  其他原料包括膠體金、酶底物系統、發光物質等信號體系，NC膜、酶標板、磁珠等反應體系載體，以及各種生物活性材料和精細化學原料等，起到幫助呈色、提供載體場所或提升原料性能等作用，以保障診斷反應穩定且順利進行。

  生物活性原料研發的基本原則

  抗原的研發無論是天然抗原還是重組抗原，抗原是制備抗原類體外診斷試劑的原料，包括原核/真核重組抗原、天然抗原等，通過基因工程重組技術、蛋白純化技術、細胞生物學技術以及化學合成技術等方法制備，適用于傳染病診斷、食品安全診斷、消化道疾病診斷以及免疫系統疾病診斷等。都是通過純化的方式獲得，針對重組抗原更重要的抗原分子的設計，表達載體和宿主的選擇。

  抗體的研發包括多克隆抗體和單克隆抗體，通過免疫技術、雜交瘤細胞技術、細胞發酵技術等方法儲備，用于心血管疾病診斷、傳染病診斷等。多克隆抗體主要通過免疫原和免疫動物，以及免疫劑量，免疫程序進行優化，單克隆抗體相對復雜還需要后期的雜交技術，細胞培養，細胞篩選，再次免疫來獲得識別特異性表位的抗體。當然有很多抗體得到后可以進行測序，通過基因重組的方式來大規模獲得。

  酶和輔酶是制備熒光定量PCR及基因診斷等分子診斷試劑、免疫診斷試劑及生化診斷試劑的原料，包括逆轉錄酶、DNA聚合酶、堿性磷酸酶等，主要適用于基因檢測、傳染病診斷、凝血診斷、肝腎功能生化診斷等多種檢測領域。酶的獲得也是主要通過純化的方式來進行。因此蛋白純化技術和抗體制備技術作為兩項關鍵的主要技術是生物活性原料開發的關鍵。會涉及到生物化學，分子生物學，免疫學，微生物學，基因工程，蛋白質工程，酶工程等多種學科。

  生物活性原料的規模化制備

  包括原材料準備，預處理，初純和精純。

  原材料準備可以直接選擇動植物的組織或細胞，或是通過基因工程手段得到的工程細胞和工程菌。

  原材料預處理，通常而言可以采用高速勻漿，液氮研磨或超聲等機械方式來破碎組織和細胞，也可以通過低滲，反復凍融，酶消化或表面活性劑處理等非機械方式，但要注意的是破碎的強度，太小釋放不充分，太大又會導致生物活性原料變性。破碎后的原料會呈現渾濁，可以通過高速離心，濾膜過濾等方式去除或者采用飽和硫酸銨沉淀后去除。

  初純階段主要通過沉淀和離心過濾的方法，常用的有硫酸銨沉淀法，優球蛋白沉淀法，等電點沉淀法等非變性沉淀法，或者利用有機溶劑，酸堿，熱等變性沉淀法。

  精純主要依據分子大小，形狀，表面電荷分布，親疏水性以及特異性結合等性質進行的各種層析分離，主要包括離子交換層析，分子篩交換層析，親和層析，疏水層析以及電泳等技術進行分離。

  生物活性原料的保存

  影響生物活性原料溶液狀態保持的因素包括pH、離子強度、污染或殘留的蛋白酶、保存的溫度和反復凍融的次數。可以通過添加一系列的，緩沖體系，低溫保存，表面活性劑，蛋白酶抑制劑，防腐劑，還原劑等來維持原材料的穩定。這里常用的技術就是凍干技術。

  生物活性原料的質量控制

  質量控制關鍵的是對每批純化后的原料進行濃度，純度鑒定，通過Elisa，蛋白定量，SDS-PAGE等方法進行，體外診斷試劑的生物活性原料應該是高純度，高活性且狀態均一的成品，應保證外觀，濃度，純度，均一性和生物活性。

  影響穩定性的原因

  在體外診斷試劑所用的原料中，抗體、抗原、酶等蛋白質是很重要的關鍵原料。其所具有的特異性結合、催化反應功能，對在預處理、貯存、使用加工等操作過程中存在的潛在有害影響非常敏感。保存在密封、干燥的環境將有助于確保長時間的穩定，但除非蛋白得到適當的保護，否則干燥過程有也可能使蛋白發生嚴重的變性。而保存在溶液狀態，潛在的危害因素將會增多。比如很簡單的一個方面，pH值或者緩沖溶液的改變就能夠使蛋白在溶液中的穩定性明顯不同。使某種溶液狀態穩定的方法并不一定就對另一種溶液有效。在生產過程中的其他因素也有可能影響產品的性能。這些因素包括原料來源、稀釋和定時錯誤、溫濕度不合適、曝光和容器材料等。為了保證診斷檢測的有效期和精確性，這些原料蛋白必須保持穩定和有效。因此，在診斷試劑中必須要添加適當的，適量的蛋白保護劑。

  干燥狀態穩定性

  盡管大多數蛋白質在溶液狀態的自然構象下發揮作用，但干燥或者冷凍狀態仍然是穩定保存的首要選擇。在這些相對穩定的狀態下，諸如蛋白酶、氧化劑等有負作用的溶劑與蛋白質的頻繁碰撞將會得到很大限度的減少。但是通過干燥或者其他相變方式，比如沉淀和冷凍，將溶劑從蛋白分子中去除，將可能損害蛋白質的功能構造。這些相變可能使通常折疊在分子內部的疏水氨基酸暴露在分子表面，從而造成蛋白質分子通過疏水表面與其他分子結合，導至蛋白質分子的變性。干燥的方式包括自然風干或者冷凍干燥，例如試劑瓶中結合物的干燥、塑料板或者膜材料上包被抗體的干燥。

  在要干燥的溶液中加入適當的溶質來防止蛋白質變性是一種非常有效的保持蛋白質穩定的方法。這些溶質的特點是都具有親水基團，這些基團通過掩蓋疏水性氨基酸從而達到穩定蛋白質功能構造的作用。因此，由于在干燥時溶劑的去除會促進蛋白與蛋白，尤其是蛋白與固相表面的相互作用，所以在干燥前加入保護劑非常重要。

  無論是干燥方法還是保存條件，想要保持穩定都有很苛刻的要求。當蛋白應用到膜上時，通常要求非常快速的干燥或者凍干，以保持蛋白性能和活力。而對于平板、試管或者微珠的蛋白包被來說，相對于快速干燥，確保組分的徹底干燥則更為重要。為了得到很大限度的有效期，所有干燥后的產品都需要保存在放有干燥劑的密閉容器中。

  溶液狀態穩定性

  雖然抗體、抗原、酶以及其他診斷用蛋白在水溶液中處于天然的機能狀態，但這并不是它們穩定的狀態。在溶液中，有眾多的因素影響著蛋白的活性功能：

  蛋白質分子變得更加柔韌易折，從而傾向于改變構象。

  蛋白質分子和其他分子以及容器壁的碰撞頻率增加了。

  微生物污染的可能性增加了。

  對溫度升高和蛋白濃度降低造成的影響更加敏感。

  蛋白質更易被氧化。

  通常來說，溶解的蛋白質分子在較低的溫度和較高的蛋白濃度下穩定。在剛好高于冰點的時候，蛋白質分子擁有較少的動能，而這些動能是蛋白質“擺脫”其能量低的功能構造所必需的。在溶液中，部分蛋白活性的損失是由容器壁的吸附、寡聚酶的解聚以及氧化劑、水解酶、微生物等痕量污染物對蛋白質的滅活等原因造成的，而在越高的蛋白濃度下(毫克每毫升范圍或更高)，損失的蛋白活性占蛋白總活性的比例也就越低。

  影響穩定性的其他因素

  蛋白來源、純化方式以及化學偶聯的方法都能影響蛋白試劑的活性和穩定性。例如，堿性磷酸酶的來源就對復合物的穩定性有重大影響;就溶液的穩定保存而言，將所需蛋白與對蛋白有傷害作用的酶(如水解酶、氧化酶)從原料中分離是非常重要的。若要保證溶液穩定，就必須去除或者滅活這些有害酶以及能產生這些酶的微生物。在合成復合物時，大量的化學反應步驟已被證明能使酶和抗體分子之間形成共價鍵。其中的一些方法對某些酶-抗體復合物的穩定負面影響較低。如果一種酶聯復合物喪失了酶聯檢測的活性但仍保持有酶活力，那么另外選擇一種化學偶聯方法也許能解決這個穩定性問題。

  有時候，被認為是穩定性方面的問題實際上是由其他變數造成的蛋白量不足。也許就是一個很明顯的稀釋錯誤。生產商必須棄用那些有可能吸收蛋白或者抑制蛋白活性的容器材料，例如未處理的聚苯乙烯、聚砜、聚碳酸酯或者玻璃。聚乙烯和聚丙烯是比較可取的容器材料。有色酶和其他含有氧化金屬離子的蛋白溶液不能暴露在陽光下。

  蛋白保護劑種類

  影響蛋白活性的因素主要有溶液的PH值、鹽分和糖分的濃度、微生物的作用及空氣的氧化等。針對市場的需要，目前市面上有很多商品化的蛋白保護劑可供臨床和科研生產廠家大批量使用，主要用于微孔板的封閉穩定、抗體稀釋液、蛋白稀釋液、酶穩定液等。選擇這些商品化的試劑在研發初期會給部分企業解決很多問題并且節省研發時間。有些企業，出入成本的考慮，也會著手研發自己的蛋白保護液配方以降低成本以及獲得更好的效果。目前蛋白保護劑主要包括：多羥基化合物、糖、氨基酸、聚合物、蛋白質等。

  原料，是診斷試劑的重點。在絕大多數項目的原料乃至優良原料唾手可得、原料來源與國際大廠比肩的如今，中國的體外診斷工業可以將更多精力和智慧集中在改進和優化工藝上，精雕細琢，終能打造蜚聲國際的精品。